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BCA蛋白濃度檢測原理、操作及常見問題

一、實驗原理

BCA與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑混合一起即為BCA工作試劑。在堿性條件下， BCA工作液與蛋白質(zhì)結(jié)合時，蛋白質(zhì)將二價銅離子還原為一價銅離子， 一個一價銅離子螯合兩個BCA分子，工作試劑變色，在562nM處有高的光吸收值，并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測蛋白的OD值，即可得到濃度值。

二、應(yīng)用范圍

1. BCA法測定蛋白濃度可以兼容樣品中高達5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween20、60、80。但本試劑盒受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響，需確保EDTA低于10mM，無EGTA，二硫蘇糖醇(DTT)低于1mM，β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol)低于0.01%。（tips：認(rèn)真看說明書， 不僅是BCA檢測試劑盒說明書， 還有蛋白裂解液說明書， 清楚裂解液的試劑配方， 如果不適用BCA法，可以考慮其他方法測定蛋白濃度）

2. 靈敏度高， 檢測濃度下限達到25μg/ml，最小檢測蛋白量達到0.5μg，待測樣品體積為1-20μl。

3. 在50-2000μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，因此樣品濃度過高需適當(dāng)稀釋。

三、實驗準(zhǔn)備

1. BCA蛋白濃度測定試劑盒

2. PBS緩沖液

3. 96孔板

4. 酶標(biāo)儀

5. 37℃恒溫培養(yǎng)箱

四、試劑配置

1. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品： 5mg/ml BSA

完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取5mg/ml BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品10μl，加入90μl的PBS稀釋為0.5mg/ml BSA（Tips：稀釋后的0.5mg/ml BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)可以一次全配好，分裝后-20℃長期保存）。

2. BCA工作液配制

根據(jù)樣品數(shù)量和重復(fù)次數(shù)， 200μl每孔計算所需工作液的體積。 BCA工作液按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量，充分混勻（Tips：由于加樣誤差適當(dāng)多配一些，配好的BCA工作液室溫在24小時內(nèi)穩(wěn)定，因此可以在提蛋白前配好）。

五、實驗操作

1. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度配制

2. 加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中。如果樣品不足20μl，需加PBS補足到20μl。（Tips：記錄加入待檢測樣品的體積）

3. 各孔加入200μl BCA工作液， 96孔板震蕩30sec，37℃恒溫培養(yǎng)箱放置30分鐘。（Tips：也可以室溫放置2 小時。 BCA法測定蛋白濃度時，顏色會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應(yīng)會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或適當(dāng)延長孵育時間）

4. 用酶標(biāo)儀測定562nM的吸光度（Tips：也可以使用分光光度計測定）。

5. 以蛋白含量(μg）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。

六、常見問題

1. 測定標(biāo)準(zhǔn)曲線時發(fā)現(xiàn)隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加吸光度或顏色沒有明顯變化。可能的原因是樣品中含有嚴(yán)重干擾BCA法測定蛋白濃度的物質(zhì)。

2. 建議每次測定時都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。因為BCA法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深，并且顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非精確控制顯色反應(yīng)的時間和溫度，否則如需精確測定宜每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 一般提取的蛋白濃度應(yīng)該在多少μg/μl？組織在1-30μg/μl，細(xì)胞低一些大概0.1-10μg/μl。

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